利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法

技术简介:本发明公开了一种利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法。利用申请人构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体,构建了含有人LF基因的重组病毒。利用家蚕作为重组病毒的宿主,表达、生产了重组人LF。解决了LF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点。家蚕幼虫体内表达的重组人LF大部分分泌在家蚕血淋巴中,非常有利于蛋白质的快速提取,利用亲和层析法纯化了重组的LF,从每头家蚕获得的产量高达400μg。利用基因工程技术用家蚕作为表达载体可以大量生产重组LF,为它在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。1、利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法,其特征在于:(1)LF基因的克隆:以人乳腺组织cDNA为模板,PCR基因扩增技术获得人LF基因,引物设计如下:正向引物:5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′,含有BamHI酶切位点;反向引物:5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′,含有BamHI酶切位点;PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下:一个循环,94℃模板变性50秒;30个循环,55℃退火30秒,70℃延伸2分钟;最后1个循环,70℃延伸10分钟;利用1%琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析,并用PCR纯化试剂盒纯化,获得全长为2136bp的LF基因,随后将LF基因克隆入3.9kb载体pCR2.1,利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆LF基因顺序正确性;(2)含有人LF基因的重组杆状病毒的构建:用限制性内切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段,然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa获得重组体pB

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