技术简介：本发明涉及一种用毕赤甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法，由LF基因的扩增、重组酵母表达载体的构建与鉴定、重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11或PMAD16、Ade+Muts表型转化子的筛选检测、Ade+Muts菌株的诱导表达、目的蛋白的纯化与鉴定、鉴定正确后转入发酵罐生长等步骤组成，该工艺生产过程简单，产品纯度高，可以开发为饲料添加剂。1.一种用毕赤甲醇酵母表达系统表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法，其特征在于，分为以下步骤： 1)LF基因的扩增：取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷冻研磨成粉末，提取总 RNA并通过反转录得到乳铁蛋白或乳铁蛋白肽的cDNA，根据乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因特征设计一对各带一个酶切位点的引物，利用RT-PCR技术得到DNA，定向克隆入大肠杆菌克隆载体，转化大肠杆菌克隆菌株，筛选阳性克隆； 2)重组酵母表达载体的构建与鉴定：将以上筛选出的阳性菌株抽提质粒，用DNA内切酶切出目的基因并纯化，将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的转移载体，得到含乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因的重组转移载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含Amp的LB平板上，培养过夜随即挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切及PCR鉴定； 3)重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11或PMAD16：线性化重组表达载体，在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂：75.0μl重组表达载体，终浓度达1.0μg/μL；3～5μL线性化酶，20.0μL缓冲液；轻轻混匀，37℃下放置12～16小时；在此期间根据InvitrogenPichi